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        1. ?生物熱點?


              近日,知名華人科學家張鋒教授與同事在《科學》雜志上發表論文,介紹了一種全新的CRISPR應用工具,用以檢測核酸。他和James Collins教授團隊,聯合將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級(aM,10的負18次方摩爾每升),可以檢測單分子的SHERLOCK技術。這一工具能快速檢測RNA或DNA分子,靈敏度甚至有望檢測出單個核酸,這一重磅研究對于科研與全球公共衛生有著極大的影響,該事件很快在生物圈內刷屏了。


          就在大家在為張鋒大神歡呼雀躍,在為CRISPR-Cas13a叫好的時候。我們發現,讓SHERLOCK技術達到阿摩爾級靈敏度的不是CRISPR-Cas13a,是它的搭檔,另一個顛覆性的發明重組聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)。很少有報道提起她,她就那樣默默站在CRISPR-Cas13a背后。


          RPA有多厲害?據說可以媲美PCR技術。什么是PCR?著名發明家Kary Mullis因為發明這個技術于1993年獲得諾貝爾獎。RPA技術被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(由英國公司TwistDx Inc開發)。以此為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產品,能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低,特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。如果張鋒和Collins教授的這項發明最終能造福人類,我們也應該記住RPA的發明人。

          常規的PCR也可以擴增特定DNA片段,提高靈敏度,但是PCR對溫度的控制有很復雜的要求,要經歷高溫變性、低溫復性還有中溫延伸三個步驟。RPA就不需要這么麻煩,它的反應需要三種在常溫下有活性的酶,最適溫度在37-42℃之間,不需要變性過程,這樣就大大加快了擴增的速度。再加上不需要溫控設備,兩者共同打造了真正便攜式的快速DNA擴增技術。


          不僅方便快捷,RPA更“迷人”的地方在于擴增量十分高,能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到能夠可以檢測到的水平。痕量,顧名思義就是“該物質雖然存在,但只有‘痕跡’,無法用一般方法定量檢測,通常含量<0.1mg”,所以大家就知道RPA有多厲害了吧?利用它可以從單分子得到大約1012的擴增產物。而且RPA還不需要復雜的樣品處理,及時環境限制,無法提取核酸,也難不倒它[4]。


          利用RPA,在室溫中,樣品中DNA或RNA的含量就可以得到提升,一旦含量增加了,再將DNA轉化為RNA。如此,Cas13a就有資格進化成“SHERLOCK”了!

          RPA與LAMP對比

            LAMP:環介導等溫擴增法的特征是針對目標DNA鏈上的六個區段設計四個不同的引物然后再利用鏈置換反應在一定溫度下進行反應。反應只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質等共同置于一定溫度下(60~65℃)、經一個步驟即可完成。

            RPA:主要依賴于三種酶:能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成,對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合,防止進一步替換。在這個體系中,由兩個相對的引物起始一個合成事件。



          RPA技術答疑

          RPA技術有哪些特性?

            RPA的特性:快速檢測 15min進行單分子檢測試驗, 簡易包裝 穩定凍干形式試劑. 無需熱循環過程 擺脫任何儀器束縛. 便攜 設備要求低,貧瘠條件亦能 完成檢測

          RPA能實現多重化嗎?

            可以。RPA技術支持在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過,多重化的引物組合需要精心設計,以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是,RPA反應的引物總量(nmol)最好不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物,就應該控制不同引物的量。另外,我們應當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。

          能否對模板進行定量?

            可以。擴增子達到可檢出水平的時間,依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多,擴增子就越快達到可檢出水平。不過,這種定量需要精心的實驗安排,確保對照反應是同時開始的。舉例來說,可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系,RPA反應就會開始。

            此外,較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度。

          能否進行熒光終點分析?

            可以。這樣比較的是反應開始時的熒光和反應結束時的熒光,熒光增強意味著發生了擴增。

          能否支持生物素或熒光標記的寡核苷酸?

            支持。在RPA反應中,連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒有發現任何差異。

          跑膠前需要回收RPA產物嗎?

            需要。RPA反應中的物質會干擾瓊脂糖電泳,如果不進行產物回收,跑出來的帶會出現拖尾。


          RPA核酸檢測系列最新應用

          犬內臟利什曼病POCT檢測

          A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care

          A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi

          Prduct used:TwistAmp nfo kit

          Paper Link:

          http://www.ajtmh.org/content/early/2015/07/30/ajtmh.15-0145.abstract

          RPA用于全基因組和基因特異性DNA甲基化檢測

          Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs

          Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau

          Prduct used:TwistAmp basic kit

          Paper Link:

          http://www.clinicalepigeneticsjournal.com/content/7/1/65

          埃及血吸蟲病RPA擴增及寡色譜測流試紙檢測

          Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection

          A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster

          Prduct used:TwistAmp basic kit;TwistAmp nfo kit

          Paper Link:

          http://www.parasitesandvectors.com/content/pdf/s13071-015-1055-3.pdf



          來源:奇點網

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          國內藥企PD-1申報情況、開發進度、臨床試驗信息匯總

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          強強聯合!RPA技術助張鋒團隊CRISPR新應用刷屏朋友圈。

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